ABSTRACT
O objetivo do trabalho foi investigar o efeito de diferentes soluções químicas auxiliares, em concentrações subcitotóxicas, na expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias, quando em contato com células da linhagem de linfoma humano, diferenciadas em macrófagos, human macrophage-like (U937), através da adição de 125ng/mL de PMA. As concentrações, citotóxica e subcitotóxica, de cada solução, foram determinadas de acordo com padrão ISO, utilizando-se fibroblastos de camundongos (L929). As células L929 foram cultivadas em meio MEM completo e mantidas em placas de 96 poços. As células foram então colocadas em contato com as diluições das soluções químicas auxiliares (a partir das concentrações recomendadas para uso, NaOCL 5,25%; CHX 2%; Quitosana 0,2%; HEBP 18%; GSE de Vitis vinífera, 6,5%), por 24 horas a 37ºC em estufa de CO2. Em seguida, o meio de cultivo contendo 1mg/mL de MTT foi adicionado aos poços em triplicata, para avaliação da viabilidade celular e determinação das concentrações citotóxicas (30% de morte das células L929) e subcitotóxicas (15% de morte) por regressão linear por meio do programa GraphPad Prism versão 6.0. As concentrações subcitotóxicas foram colocadas em contato com as células human macrophage-like (U937) por 60 min. Os sobrenadantes da pré-incubação (controles sem substâncias químicas auxiliares), e incubação com as soluções químicas auxiliares em meio DMEM completo foram congelados em freezer ultrafrio ( 80ºC) e avaliados para as concentrações de dezessete citocinas através do kit Bio-Plex Pro Human Th17 Cytokine Panel® pelo método Luminex®. Foi possível obter valores de expressão de 7 citocinas pró-inflamatórias: IL-1ß, TNFα, IL-6, IL-17A, IL-17F, IL-22 e IL-23. As substâncias com maior atividade citotóxica (padrão ISO para morte celular) foram em ordem de grandeza, a quitosana, a CHX, o NaOCl, o HEBP e o GSE de Vitis vinifera. As concentrações subcitotóxicas das soluções químicas auxiliares, CHX e NaOCl, induziram ao aumento da maioria das citocinas pró-inflamatórias, exceto para a IL-6. Quanto a IL-1ß, a quitosana e a CHX, estas foram as que mais induziram a expressão pelas células U937 (P<0,05),enquanto o NaOCl induziu maior expressão de TNFα (P>0,05). Dentre as citocinas relacionadas ao fenótipo Th17, a CHX foi a que mais induziu a expressão de IL-17A (P<0,05), IL-17F e IL-23, seguido do NaOCl(P<0,05). O NaOCl induziu maior expressão de IL22 seguido da CHX (p<0,05). Quanto a IL-6, todas as substâncias modularam a sua expressão pelas células U937(p>0.05). O HEBP atuou como um excelente modulador da expressão de citocinas pró-inflamatórias, induzindo a redução da expressão de todas as citocinas testadas (P<0,05). O GSE de Vitis vinifera, apesar de ser o menos citotóxico não apresentou diferença estatística para o controle em nenhuma das situações avaliadas, exceto para a redução da IL-6 (assim como o HEBP e a quitosana) (p<0,05). A quitosana comportou-se de forma similar ao GSE de Vitis vinífera (p>0,05) exceto para a IL-1ß. Conforme observado, as substâncias químicas auxiliares são capazes de induzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias diversas. O HEBP foi o agente químico que melhor modulou a expressão de citocinas pró-inflamatórias.
The aim of this investigation was to analyze the effect of different chemical endodontic solutions, in subcytotoxic concentrations, on the expression of pro and anti-inflammatory cytokines when in contact with human lymphoma lineage differentiated into human macrophages, human macrophage-like (U937), by the addition of 125ng/ml PMA. The cytotoxic and subcytotoxic concentrations of each solution were determined according to ISO standard using mouse fibroblasts (L929). L929 cells were cultured in complete MEM medium and maintained in 96-well plates. Dilutions of the auxiliary chemical solutions, from the recommended concentrations for use: NaOCL 5,25%; CHX 2%; Chitosan 0.2%; Etidronic acid 18% and Grape seed extract, Vitis vinifera, 6.5%, were carried out in complete MEM medium, and placed in contact with the cells for 24 hours at 37ºC in CO2 cell incubator, in triplicate. Thereafter, the culture medium containing 1 mg/mL MTT was added to the wells. Cytotoxic concentrations (30% death of L929 cells) and subcytotoxic (15% death) were determined by linear regression using GraphPad Prism version 6.0. Subcytotoxic concentrations were obtained in complete DMEM medium and maintained in contact for 60 min. with U937 cells. Controls without chemical substances were also performed. Supernatants from the pre-incubation, incubation with the chemical solutions and complete DMEM were removed, frozen in ultra-cold freezer (-80ºC) and evaluated for the concentrations of 17 cytokines through the Bio-Plex Pro Human Th17 Cytokine Panel® kit by Luminex®. The substances with higher cytotoxic activity were in order of magnitude: chitosan, CHX, NaOCl, etidronic acid and Vitis vinifera extract. The values of 7 pro-inflammatory cytokines: IL-1ß, TNFα, IL-6, IL-17A, IL-17F, IL-22 and IL-23 were obtained. Subcytotoxic concentrations of the irrigant agents (chlorhexidine and NaOCl) generally induced the increase of most pro-inflammatory cytokines, except for IL-6. Chitosan and CHX were the agents that most induced the expression of IL-1ß by U937 cells, whereas NaOCl induced higher TNFα expression (P> 0,05). Among the cytokines related to the Th17 phenotype, CHX was the agent that induced the highest expression of IL-17A (P <0,05), IL-17F and IL-23, followed by NaOCl (P<0,05). NaOCl induced the highest expression of IL22 followed by CHX. All of the substances modulated the expression of IL-6 by U937 cells (P >0,05). HEBP was an excellent modulator of the expression of pro-inflammatory cytokines, inducing the reduction of the expression of all cytokines tested. Vitis vinifera extract, despite being the least cytotoxic agent, did not present statistical differences compared to the control for any of the evaluated cytokines, except for the reduction of IL-6 (as well as etidronic acid and chitosan) (P<0,05). Chitosan, except for IL-1 ß, was very similar to the Vitis vinifera (P>0,05) extract. As observed, the auxiliary substances (especially the irrigants) are capable of inducing the expression of various pro-inflammatory cytokines. Etidronic acid was the chemical that modulated the expression of pro-inflammatory cytokines.